Le projet

metaSEED est un projet de recherche régional visant à étudier la diversité des communautés de micro-organismes associées aux semences par des approches de type métagénomique. Ces approches sont basées sur le séquençage ciblé ou aléatoire d'échantillons collectés au sein de différents ecosystèmes comme les océans, les sols, les aliments ou le tube digestif. Au cours de cette journée nous proposons de vous présenter différents projets de recherche faisant appel à la métagénomique.

 

Les Partenaires du projet

Figure1

metaSEED est porté par 2 partenaires principaux, les équipes EmerSys et FungiSem de l'Institut de Recherche en Horticulture et Semences (IRHS, http://www6.angers-nantes.inra.fr/irhs), ainsi que 4 partenaires associés : l'UPRES EA 3859-Université D'Angers ; la plateforme Bioinformatique GenOuest et les entreprises semencières Vilmorin et HM-Clause. Par ailleurs, les producteurs de semences, par l'intermédiaire de la Fédération Nationale des Agriculteurs Multiplicateurs de Semences (FNAMS), sont également représentés dans ce projet de recherche.

 

Le contexte

Figure2

Les ensembles microbiens associés aux plantes (ou microbiote) peuvent avoir des effets bénéfiques ou néfastes pour la croissance et la santé des plantes. En effet, les variations de composition de ces ensembles peuvent impacter la production de biomasse végétale, la composition en métabolite secondaires ou bien encore la cinétique de floraison. Par ailleurs, le microbiote des plantes peut inhiber ou au contraire favoriser le développement de certains agents phytopathogènes. Pour l'ensemble de ces raisons, il est nécessaire de mieux comprendre les processus impliqués dans la formation de ces ensembles microbiens au cours du cycle de développement de la plante.

 

A ce jour la structuration de ces ensembles microbiens a été majoritairement appréhendée au sein de deux habitats : la rhizosphère et la phyllosphère ; lors du développement végétatif de la plante. En revanche, d'autres habitats comme les fleurs, les fruits ou les graines ont été largement ignorés. Pourtant les graines sont une source d'inoculum importante pour la plantule et possèdent des ensembles microbiens abondants et diversifiés (Barret et al., 2016 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/mpp.12382/abstract; - Figure 3 et Figure 4)

 

Figure3   Figure 4A

 

 

L'enjeu du projet metaSEED vise à comprendre le fonctionnement des communautés microbiennes associées aux semences pour assurer, à terme, une gestion optimale et une meilleure performance des cultures. Atteindre cet objectif passe par la compréhension de la dynamique de la structure des communautés microbiennes associées aux semences et l'étude de leur fonctionnement. Les nouvelles approches méthodologiques comme la métagénomique, permettent aujourd'hui des études écologiques exhaustives du microbiote des plantes. C'est ce type d'approche qui est mis en œuvre dans le projet metaSEED pour étudier les ensembles microbiens associés aux semences.

 

Le projet metaSEED s'articule autour de 4 axes opérationnels détaillés dans les paragraphes ci-dessous et résumés ainsi :

Figure5
 

Axe opérationnel 1 : Dynamique du microbiote des semences lors de la germination-levée

Figure6

La structure du microbiote des semences issues de plantes représentant différents génotypes, variétés, espèces, genres, tribus et familles végétales (Figure 6) a été étudiée par une approche de metabarcoding en ciblant 2 marqueurs moléculaires fréquemment employés pour étudier la composition des communautés bactériennes (une portion du gène codant l'ARNr 16S) et fongiques (ITS1). Un marqueur moléculaire bactérien alternatif au gène codant l'ARNr 16S, basé sur une portion du gène gyrB, a également été développé et utilisé lors de cet axe. Ce marqueur permet d'atteindre un niveau taxonomique infra-spécifique. Par ailleurs, la dynamique du microbiote des semences a été appréhendée lors de la germination-levée en collectant, en conditions stériles, des graines germées (24h après imbibition) et des plantules (96h après imbibition).

 

Nos résultats indiquent une très grande hétérogénéité de richesse bactérienne entre les lots de semences, et cela au sein d'une même espèce végétale (de 5 à 300 unités taxonomiques opérationnelles ou OTUs ; Figure 7). Par comparaison, la richesse fongique est moins variable avec une richesse médiane d'environ 50 OTUs par échantillon de semences (Figure 7 ci-dessous).

 

Figure7

 

Lors de la levée, la richesse microbienne diminue de façon significative en conséquence de l'augmentation de l'abondance relative de certains taxons bactériens et fongiques. Des membres de ces taxons microbiens ont été fréquemment isolés d'autres compartiments végétaux tels que les racines, les feuilles ou les fruits, ce qui semble indiquer que la graine est une source d'inoculum importante pour la plantule (Figure 8 et Figure 9). L'ensemble de ces résultats a été valorisé par une publication acceptée dans Applied and Environmental Microbiology (Barret et al., 2015 ; http://aem.asm.org/content/81/4/1257.full).

 

Figure8Figure9

 

 

Les échantillons de semences analysées au cours de cet axe opérationnel sont issus de différentes années de récolte et zones de productions. L'influence relative des zones de productions, années de récolte ou espèce végétale sur la structuration des ensembles microbiens associés aux semences a été analysée sur les données générées lors de cet axe. Nos analyses semblent indiquer une influence de la zone de production sur l'assemblage des entités fongiques associées aux semences. Afin de valider cette hypothèse, nous avons entrepris une étude en collaboration avec l'UMR SAD-Paysage de Rennes. Au cours de cette étude 5 cultivars de haricots ont été semés dans 2 zones de productions distinctes. L'étude de la composition des communautés microbiennes associées aux semences de la génération n+1 a permis de mettre en évidence une influence significative de la zone de production sur la composition des ensembles fongiques associés aux semences (Figure 10 ci-dessous). En revanche ni le cultivar ni la région de production ne semble influencer la structuration des ensembles bactériens. Ces travaux ont été valorisés par une publication parue dans Environmental Microbiology (Klaedtke et al., 2016 ; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/1462-2920.12977/abstract).

Figure10

 

Axe opérationnel 2 : Analyse métagénomique des microbiotes des semences et des plantules (en cours de rédaction)

Lors de ce second axe, les métagénomes d'un nombre restreint de microbiotes de graines, graines germées et de plantules ont été analysés par séquençage aléatoire massif. Le but de cet axe opérationnel est de comparer le potentiel fonctionnel de ces microbiotes lors de la germination-levée et d'isoler certaines classes fonctionnelles enrichies au cours de ces stades de développement. Nous avons choisi d'étudier des semences issues de 3 espèces végétales distinctes (radis, carotte et haricot). En effet, ces semences possèdent des niveaux de diversité variée (faible, moyenne et forte).

L'analyse de la composition taxonomique et fonctionnelle de ces métagénomes est effectuée depuis le mars 2016 par une post-doctorante (Gloria Torres-Cortes) recrutée pour une durée de deux ans grâce au projet DynaSeedBiome du RFI Objectif Végétal.

 

Axe opérationnel 3 : Effet d'agents phytopathogènes sur la composition du microbiote des semences et leur métagénome associé.

Dans ce troisième axe opérationnel, l'impact de l'invasion du microbiote de graines de radis par des agents pathogènes a été analysé. Des contaminations artificielles de la bactérie Xanthomonas campestris pv campestris (Xcc) et du champignon Alternaria brassicicola (Ab) ont été effectuées sur les parties aériennes de porte graine cultivées (Figure 11, Figure 12).

Figure12    Figure11

 

 

Après récolte, l'installation des agents pathogènes au sein des semences de radis a été mesurée par des analyses classiques de microbiologie et de biologie moléculaire. La diversité microbienne présente au sein des échantillons de semences a ensuite été caractérisée par une approche de séquençage de marqueurs taxonomiques bactériens et fongiques. Les résultats de cette étude indiquent que la transmission de Xcc n'affecte pas la composition du microbiote des semences. En revanche la transmission d'Ab diminue significativement la diversité des ensembles fongiques associés aux semences (Figure 13 ci-dessous). Cette perturbation est probablement due à des compétitions pour les ressources nutritives entre Ab et d'autres membres de la communauté fongique, notamment des souches saprophytes apparentées à l'espèce Alternaria alternata. Ces travaux ont été valorisées par une publication dans la revue PeerJ (Rezki et al., 2016 ; https://peerj.com/articles/1923/).

Figure13

 

Afin de prédire les interactions se déroulant entre entités microbiennes au sein des semences, des réseaux de co-occurrence entre OTUs ont été calculées (Figure 14). Ces réseaux permettent d'inférer de potentielles interactions compétitives entre OTUs et donc de cibler certaines souches à isoler. L'isolement et le typage de 300 souches bactériennes et 150 souches fongiques a été effectuée à partir des différents lots de semences de radis récoltées au cours des différentes années sur des milieux de culture synthétiques. Le potentiel antagoniste de ces souches vis-à-vis de Xcc et Ab sont actuellement testés dans des dispositifs de confrontations directes (Figure 15 et Figure 16). En fonction des résultats obtenus, ces isolats pourraient être ensuite utilisés en tant qu'agent de contrôle biologique pour empêcher la transmission d'agents phytopathogènes aux semences.

Figure14 

(Figure 14)

 

Figure15   Figure16

(Figure 15)                                               (Figure 16)

 
Figure 17

Le séquençage aléatoire du métagénome des semences de radis collectées au cours des différentes années a également été initié en utilisant deux technologies distinctes : un séquençage profond HiSeq3000 (40 million de reads par échantillon) et un séquençage PacBio longread. L'objectif de ce séquençage est d'essayer de reconstruire les séquences génomiques des populations microbiennes majoritaires au sein des semences. Les premiers résultats d'assemblages de novo et de binning (Figure 17) ont permis de reconstruire l'intégralité du génome de la souche de Xcc.

 

Axe opérationnel 4 : Méta-analyses des microbiotes et des métagénomes

Au cours du dernier volet du projet metaSEED, nous souhaitons intégrer des données de séquençage effectué sur l'ensemble des tissus végétaux (graine, racine...) et leurs environnements (spermosphère, rhizosphère...) aux séquences obtenues lors des axes opérationnels précédents sur l'ensemble du développement végétal (dispersion, germination, inflorescence...) afin de réaliser des méta-analyses au niveau des différents compartiments dans chacun des stades de ce développement.

Pour réaliser les méta-analyses, nous nous sommes appuyés sur trois grandes bases de données internationales: SRA, ENA et DDBJ. Pour plus de détail aller à http://www.info.univ-angers.fr/~gh/Metaseed/cs_axe4_2015.php

Pour les analyses de type amplicon 16S, nous avons déjà mis au point courant 2014 un script écrit en perl nommé metauto (METAgenomic AUTOmatic analysis, http://www.info.univ-angers.fr/~gh/Metaseed/metauto16S.php ). Nous avons étendu ce script à gyrB en 2015 et déployer ces scripts sur Galaxy.

 
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